本篇目的：以实例解决qPCR数据处理及统计分析作图问题
方法：相对定量法
工具：Excel、Graphpad prism 8.2
结果：得到一幅可说明既定目的基因组间表达差异，用于文章发表的图
正文：
正常一次qPCR反应可以得到两个曲线，扩增曲线及溶解曲线（能看懂并分析最好，看不懂也不影响单次数据分析）扩增曲线：随着PCR反应进行，荧光信号强度随着扩增产物增加而增强，进而检测扩增产物的变化。溶解曲线：随着温度升高DNA双螺旋结构降解程度曲线
使用相对定量法首要关注的是Ct值（部分软件会显示为Cq值）。
首先明确Ct值定义，即：PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。平行孔之间Ct值相差最好不要超过0.5。2^-△△Ct为最常用的方法，表示实验组中目的基因较对照组中目的基因表达的差异倍数，计算公式首先：
△Ct（实验组）= Ct（实验组目的基因）- Ct（实验组内参基因）；
△Ct（对照组）= Ct（对照组目的基因）- Ct（对照组内参基因）；
△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）
最后表达水平的差异倍数用2^-△△Ct表达。
看不懂公式没关系，结合以下实例操作说明：
一、数据整理
1、用Excel整理内参及目的基因表达数据（3个副孔为例）
（图1）
（图2）
2、空白（blank）组：
①△Ct（对照组）= Ct（对照组目的基因）- Ct（对照组内参基因）：可得到图2 caspase-1相应△Ct
②△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）：△Ct取均值“12.28333”，再用每个△Ct减去均值，得到△△Ct
3、实验组：以LPS组为例
①△Ct（实验组）= Ct（实验组目的基因）- Ct（实验组内参基因）：这里的实验组内参基因见图1，计算后得到相应△Ct
②△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）：上一步得到的△Ct减去图中对照组均值“12.28333”，以此类推。
注意，blank组最终值在“1”上下波动，但不能简单认为相对表达量就是1。此
外，△△Ct不可直接用平均值计算。
二、统计分析并作图
1、打开prism，选择“column”
2、输入数据
3、在“Graph”里得到相应图形
4、统计分析
点击“analyze”，进行相应操作
得到相应数据，使用添加文本功能，用“”号把有统计学意义数据标注在图上。
以上。
在此感谢韩倩同学指导、协助分析~
