QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性，以及检测低效且不灵敏。两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。详细实验内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn。
优化了测定后，重要的是验证反应效率。在报告和比较测定方案时，此处信息非常重要。在本文的实验方案示例中，比较了在广泛和狭窄的cDNA浓度动态范围上的测定效率。在实践中，通常根据样品的预期目标范围来选择一个单个测试范围，因此可以根据实验要求调整给定的实验方案。在本文的示例中，使用10倍和2倍连续稀释液计算效率。标准曲线应包含目标基因的预期表达范围。注意，使用ReadyScriptt®RT试剂盒时，cDNA产量与RNA输入的比例是线性的，因此如果使用RT-qPCR系统的话，可通过下列操作将本文的实验方案改编成适用于那个系统的：1）稀释RNA，并运行RT反应；2）然后在每个得到的cDNA样品上运行qPCR（相关示例请参见）。 然而，情况并非总是如此，并不适用于所有逆转录试剂盒或实验方案。在将此实验方案改编用于替代试剂盒之前，应进行验证。
设备
定量PCR仪器
PCR设置的层流罩（选购件）
试剂
用作标准曲线模板（例如cDNA、gDNA或合成模板）的DNA
KiCqStart SYBR®Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03—取决于仪器，参见表 P4-6)。
PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
用于测试基因的正向和反向引物（10 μM储备）。
耗材
无菌过滤器移液管吸头
无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)
PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：• 单个独立的薄壁200μLPCR管（Z374873或P3114）• 孔板 - 96孔板 (Z3749038) - 384孔板 (Z374911)• 孔板密封 - ThermalSeal RTS™ 封膜 (Z734438) - ThermalSeal RT2RR™ 封膜 (Z722553)
本方案注意事项
使用随机引发或oligo-dT方法生成cDNA（参见标准逆转录实验方案（两步法））。稀释RT产物以制备标准曲线（作为示例给出1:2和1:10）。也可以稀释RNA，而且可以使用ReadyScript® 试剂盒从每个稀释液中合成cDNA，或者通过稀释RNA，采用逆转录实验方案（一步SYBR® Green I 染料检测）和逆转录实验方案（一步探针检测）中的一步RT-qPCR法。另外，可以替换DNA模板，使得预期的Cq范围在Cq15至Cq38内。
对连续稀释液的每个浓度都重复进行反应。
方法
1. 按表P16-40制备足以进行40次反应的qPCR预混液。只进行32次反应，额外的液体作为移液出错时备用（表P16-41）。
表P16-40.用于生成1:2和1:10标准曲线的反应预混液。
2. 2. 对DNA进行一系列1:10和1:2稀释，每个系列覆盖7个稀释点（见表P16-41，DNA稀释板布局）。
3. 向已标识好的孔中加入5 μL的适当的模板稀释液（参见表P16-41，DNA稀释板布局）。
表P16-41.96孔板布局的前四列示意图，显示了标准曲线模板稀释的位置。所述稀释是相对于原始原液而言的。当使用人工模板时，可以计算拷贝数（相对于OD读数）。
4. 每孔加入15 μL预混液（见表P16-41）。
5. 给试管盖上盖子，或密封好板子，并贴上标签。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。）
6. 根据以下两步方案操作样品。重复执行第1-2步40次。接着用标准解离曲线分析进行扩增。
表P16-42.生成标准曲线的 PCR 循环条件。
说明：使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。
